序言 ............................................................... 2 試驗前準備工作 ..................................................... 2 方法 ............................................................... 4 實施內容 ........................................................... 4 結果 ............................................................... 5 結論 ............................................................... 6 附注 ............................................................... 6 參考資料 ........................................................... 6 初始污染菌檢測規范 ................................................. 7 確定滅菌劑量 ....................................................... 9 無菌檢查 .......................................................... 10
序言
本實驗是對醫用產品公司的一次性醫療用品進行了輻射滅菌劑量設定和驗證。實驗原理是基于ISO11137-2：2006的方法，即先對輻照前產品的初始污染菌進行測定，然后選擇驗證劑量。再用驗證劑量對產品進行輻照，并測定輻照后存活微生物的樣品件數，以此來確定所確定的驗證劑量能夠滿足10-6的滅菌保證水平。本實驗從 年 月 日開始** 年 月 日結束。
試驗前準備工作
一、樣品
1樣品：醫用產品，三個批號： 生產企業： 公司。 2器具及試劑 2.1器材 試管 容量瓶
三角燒瓶 酒精燈 滅菌剪刀、鑷子 滅菌平皿（9cm） 75％乙醇棉
滅菌刻度吸管(1ml、5ml)
紫外可見分光光度計 立式
壓力蒸汽滅菌器 電熱鼓風干燥箱 酸度計 恒溫培養箱 電熱恒溫水浴鍋 生化培養箱 電熱恒溫干燥箱
2.2培養基及試劑： a)流體硫乙醇酸鹽培養基 b)改良馬丁培養基 c)營養瓊脂培養基
2.3稀釋液、沖洗液及其制備方法 a)質量濃度為9g/L的無菌氯化鈉溶液
b)0.1％蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調節pH值**7.1±0.2，分裝，滅菌。
c)pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。 二、實驗前準備 2.1培養基要求：
用于培養需（厭）氣菌和真菌的培養基的制備、培養基靈敏度檢查及其他各項要求應符合《中G藥典（二部）》附錄中《無菌檢查法》的規定。
培養基使用按中G藥典方生產的符合規定的脫水培養基。制備后采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養基保存在2～25℃、避光的環境。
2.2器具滅菌：與供試液接觸的所有器具應采用可靠方法滅菌，置壓力蒸氣
滅菌器內121℃30min，或置電熱干燥箱內160℃2h。
2.3無菌室要求：無菌室操作臺局部符合潔凈度100級單向流空氣區域要求。無菌室在消毒處理完畢后，檢查空氣中的菌落數，方法如下：取直徑約90mm培養皿數支，無菌操作注入融化的營養瓊脂培養基約20mL，在30℃～35℃培養48h證明無菌后，取3只培養皿在無菌室操作臺或超凈工作臺平均位置打開上蓋，暴露30min后蓋好，置30℃～35℃培養48h后取出檢查，3只培養皿上生長的菌落數平均不得超過1個。
無菌試驗過程中檢查空氣中的菌落數，方法同上。在試驗開始進行時打開平皿蓋，**試驗結束蓋好照上法培養，符合上述要求。 2.4陽性對照：
選擇金黃色葡萄球菌為對照菌，接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養物**營養瓊脂培養基中，23～28℃培養24～48小時，將上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液。陽性對照試驗的菌液制備方法驗證試驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照管培養48～72小時應生長良好。 2.5陰性對照：
取相同稀釋液、沖洗液同上法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。方法
客戶提供生產的醫用產品，每件醫用產品均是一個獨立的單元產品，其樣品份額為1。具體步驟如下：
1. 隨機抽取連續三批常規生產的產品，每批10件，共30件做生物負載檢測。另從其中一批隨機取5件樣品，做回收率實驗。
2. 當每個批平均生物負載都不超過三批總平均生物負載的2倍時，根據三批的總平均負載的檢測結果，選擇滅菌保證水平為10-2的滅菌劑量作為驗證劑量。
3. 對以上三批抽樣產品連續生產的110件產品實施驗證劑量，實際吸收劑量應在驗證劑量的±3%之內。
4. 對用驗證劑量輻照過的100件產品做無菌實驗，其余的10件產品做無菌試驗的驗證實驗。 5. 根據無菌實驗的結果，確定驗證劑量是否被接受，即確定的驗證劑量是否能夠滿足10-6的滅菌保證水平。
實施內容
一、回收率測定
取5ml洗脫液洗脫5支產品，分別洗脫四次，然后將樣品用營養瓊脂做瓊脂覆蓋，于37℃培養箱中，培養48±2h，記錄結果并得出修正系數。 二、初始污染菌測定 #p#分頁標題#e#
將隨機抽取的30件樣品中生物負載進行評估，編號后，分別用5ml 洗脫液洗脫，吸取1ml置于9ml稀釋液中，振搖均勻后分別取1ml樣品液于兩個平皿中，記錄編號為101，102，代表五十倍樣，取1ml置于9ml稀釋液，振搖均勻后分別取1ml樣品液于兩個平皿中，記錄編號為1001，1002，代表五百倍樣。依次取第二件樣品，**30件樣品。傾注營養瓊脂，于37℃培養箱中，培養48±2h，記錄結果。 三、確定驗證劑量
ISO 11137：2006 醫療器械滅菌的有效性確認和常規控制的要求中規定，若批次平均生物負載的每一個生物負載數值< 總的平均生物負載*2，則用總的平均生物負載，若一批或更多批次的平均生物負載≥總的平均生物負載*2，則用**高批次。本次試驗采用總平均初始污染菌120（cfu/SIP）確定驗證劑量。查ISO11137：2006 表格得出對應的驗證劑量為8.2kGy，該試驗劑量下的無菌保證水平SAL為10-2。 四、驗證劑量輻照結果
從產品的單個批次中選出110個單元產品的樣本，暴露在XXXXX公司的電子加速器傳送帶上輻照，使輻射劑量落在8.2±5% kGy 范圍內。輻照后進行無菌試驗。 五、無菌試驗 5.1供試液制備及接種
取樣品按容器內表面積每10cm2加入浸提介質1ml的比例，振搖數次。收集上述沖洗液或浸提介質于無菌容器中。 5.2無菌檢驗培養溫度
硫乙醇酸鹽流體培養基，置30～35℃培養。 改良馬丁培養基，置23～28℃培養。 5.3接種
采用直接接種法
每管培養基的**低用量——硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少于10 ml。 5.4培養、觀察
上述含培養基的容器分別置規定溫度的恒溫培養箱中，除陽性對照管和陰性對照管培養48～72小時外，其余管培養14天。培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。
結果
對三批醫用產品進行初始污染菌測試后，修正系數為1.08，結果如下：
批 號 初始污染菌平均數（cfu/件）
總平均數因此，根據ISO11137-2：2006建立滅菌劑量的規定，選用總平均生物負載為120（cfu/件）來確定驗證劑量。
根據以上數據查表得驗證劑量為 kGy,對以上 批次110件，實測劑量為 kGy（見輻照證明書）。經觀察，100件樣品經驗證劑量輻照后的無菌檢查陽性數為零。
結論
依據ISO 11137 ：2006 規定，當SAL=10-6時，醫用產品的滅菌劑量為 kGy。在隨后的常規輻照滅菌過程中，應通過劑量計監測，證明每一個產品的**小吸收劑量能夠達到 kGy 的滅菌劑量，使滅菌保證水平為10-6SAL。依據ISO 11137 ：2006 標準，為了確保作為10-6SAL的滅菌劑量持續有效，必須按照規定的周期進行驗證劑量審核，通常每三個月進行一次。附注
1、 試驗樣品不可替代批量產品。
2、
當批量產品輻照時的劑量確定，必須隨機抽取該批量部分產品作初始污染菌驗證。
